两个来自非脱羧勒克菌的MDR质粒耐药机制研究（二） 药机氯霉素耐药基因catB3

2.3.3质粒外源插入区

p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM均只含一个MDR区。两个勒克粒耐p707804‑CTXM中Tn6810为新型转座子，自非R质制研包含β‑内酰胺类耐药基因blaCTX‑M‑3、脱羧blaOXA‑1和blaTEM‑1，菌的究氨基糖苷类耐药基因aacA4，药机氯霉素耐药基因catB3，两个勒克粒耐利福平耐药基因arr3以及磺胺类耐药基因sul1。自非R质制研

Tn6810（图3）由Tn3家族的脱羧Tn1696进化而来，为Tn1696的菌的究衍生物，插入在质粒复制相关区与稳定相关区的药机基因间隙中，其两端为同源重组形成的两个勒克粒耐5 bp正向重复序列（direct repeat;target site duplication,DR)ATACA。Tn1696是自非R质制研Tn3家族Tn21亚群的单元转座子（unit transposon），由1型整合子In4插入至res（重组位点，脱羧resolution site）位点形成，菌的究其结构为：IRL(inverted repeat left,药机5'端反向重复序列）‑tnpA（转座酶基因）‑tnpR（解离酶基因）‑res‑mer（汞抗性位点）‑IRR(inverted repeat right,3'端反向重复序列）[22]。相较Tn1696,Tn6810有两点明显不同：(1)IRL被插入序列IS4321R打断成两段；(2)In1684替代了Tn1696的In4。

In1684为简单1型整合子（concise class 1 inte‑gron），包含5'‑CS、基因盒（gene cassette array,GCA）和3'‑CS，基因盒为aacA4-blaOXA‑1-catB3-arr3，分别为氨基糖苷类、β‑内酰胺类、氯霉素和利福平耐药基因（图3）。Tn6320插入至3'‑CS的qacED1中，使In1684被打断，两端形成5 bp DR(TAATC）；同时Tn6502插入至blaTEM‑1下游介导blaCTX‑M‑3转移。

pP12375‑CTXM的MDR区插入至orf531，把orf531打断，形成两端5 bp DRs(AACTA），其由Tn6322（含汞抗性位点，mer locus）、ISKpn25、IS1R、In609、IS26以及ΔISPa38构成（图4）。In609为复合1型整合子（complex class 1 integron），包括5'‑CS、VR1(variable region，可变区）/GCA、VR2和3'‑CS,VR1为基因盒：gcuD2-aacA4′-17（氨基糖苷类耐药基因）-gcuE14-catB8（利福平耐药基因），VR2为ISCR1及其下游的blaCTX‑M‑9。

3 讨论

目前，产ESBL菌株的出现已较为普遍，移动元件包括质粒携带β‑内酰胺耐药基因是主要原因。其中β‑内酰胺类耐药基因blaCTX‑M通常存在于IncF、IncI、IncN、IncHI2和IncL/M等质粒中，由插入序列ISEcp1或ISCR1介导，形成如Tn6502(ISEcp1-blaCTX‑M‑3-orf477）或Tn6503(ISEcp1-blaCTX‑M‑14-IS903D）转座单元，在blaCTX‑M和其他ESBL基因转座过程中扮演重要角色，在相同或不同种属的肠杆菌科细菌间进行水平转移和传播。ISEcp1属于IS1380家族，与普通的插入序列不同，ISEcp1为单末端插入序列，仅靠单个插入序列即可介导其下游邻近的耐药基因进行转移，从而大大提高了耐药基因转移的概率。ISCR通过滚环复制，导致含有相邻耐药基因的环形DNA分子形成，从而插入到其他位置，常见的为插入到1型整合子3'‑CS下游形成VR2区。

非脱羧勒克菌中的blaCTX‑M并不多见，目前关于携带blaCTX‑M‑3/blaCTX‑M‑9的非脱羧勒克菌，美国国家生物技术信息中心（NCBI)(https：//www.ncbi.nlm.nih gov/search/）中仅有3例，如2012年韩国报道了携带blaCTX‑M‑3和blaTEM‑1的菌株（登录号：JX129230）但并未测得基因组全序；本研究室前期已发现1株携带blaCTX‑M‑9的IncR型质粒（登录号：MK036885）的非脱羧勒克菌，以及收集了1株携带blaCTX‑M‑3的勒克属菌株119287（登录号：CP046445）。

箭头表示基因，不同颜色代表不同的基因功能分类；阴影部分表示同源区域；核苷酸同源性>95%

本研究中，pP12375‑CTMX的MDR区内，blaCTX‑M‑9由ISCR1介导，插入至整合子的3'‑CS，其与本研究室前期发现的携带blaCTX‑M‑9的p16005813C(IncR）质粒的结构极为相似（图4）。菌株16005813分离自宁波李惠利医院呼吸内科患者痰液标本，这两株菌来自不同省份、pP12375‑CTXM与p16005813C质粒类型不同却携带较为相似的移动元件，其主要差异有：(1)p16005813C中MDR区总长较长：不仅骨架部分较长，且外源插入也较多，相较pP12375‑CTXM，增多了ΔTn9、ISKpn25以及其他6个IS;(2)pP12375‑CTXM中无IS26‑tet(A）‑IS26 unit，仅存在单个IS26。Tn6810中，blaCTX‑M‑3由ISEcp1介导，通过识别其自身的IR和Tn6502下游另外一个与IRR‑1序列高度相似的IRR‑2(5'‑TTAATGAATTGGGG‑3'）介导Tn6502整体在细菌间的传播。

携带blaCTX‑M等多种耐药基因的质粒p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM分别介导非脱羧勒克菌150707804和P12375对青霉素类、头孢菌素类和单环β‑内酰胺类抗生素耐药。p707804‑CTXM为携带blaCTX‑M‑3的首个非脱羧勒克菌测序质粒，表明这两个质粒分别是该耐药菌携带多种耐药基因的重要载体，是耐药菌传播和扩散的基础，为阐明非脱羧勒克菌多重耐药机制提供了更多依据。

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